蔡司激光共聚焦显微镜获取高质量的共聚焦图像

　　同为蔡司激光共聚焦显微镜的粉丝，您是否也想在研究工作过程中拍摄出神奇美妙的显微图像呢?今天，蔡司君就和您分享一些有关共聚焦成像的小知识，从参数设置方面入手，助您最终获取理想的图像。

 　　下图为采用Airyscan2技术Multiplex模式拍摄的DNA染色的海拉细胞，由德国哥廷根马克斯・普朗克生物物理化学研究所A. Politi、J. Jakobi‍以及‍P. Lenart‍提供。

　　01物镜选择及光路设置

　　首先如果您想获取一张漂亮的图像，合适的物镜选择以及正确的光路设置是必不可少的。

　　物镜

　　物镜本身上面有几个重要的参数，分别是放大倍数、NA(数值孔径)以及所需介质：

　　▪ 放大倍数直接关系到您能看到的视野的大小;

　　▪ NA值跟分辨率有直接的关系，选择数值孔径(NA)越大的物镜，分辨率越好，看到的细节越多;

　　▪ 使用合适的介质也很重要。有些物镜的要求是Air，即空气镜;有些的标注是W，即水镜;还有些是Oil，即油镜。在使用物镜前要注意介质的正确使用哦。

　　▲ 不同介质的物镜(从左到右依次为空气镜、油镜和水镜)

　　光路设置

　　▪ 使用过蔡司激光共聚焦显微镜的小伙伴们都知道，我们软件里面有Smart Setup，可以直接选择染料信息，硬件自动配置好所需的一切，简单容易上手。

　　▲ Smart Setup染料设置界面

　　▪ 如果您对实验有其他的要求也可以自己设置光路，设置需要的激光、检测器和收集波段。所以实验前一定要清楚自己所使用染料的激发波段和发射波段哦。

　　▲ Imaging Setup界面

　　02图像采集参数设置

　　什么是好看的共聚焦显微图像呢?可能每个人对美的定义不同，但是想得到一张漂亮的图像也需要具备*基本的三个条件，分别是荧光强度合适、优异的信噪比、较高的分辨率。

　　荧光强度

　　影响荧光强度的主要有三个参数，分别是激光强度(Laser)、针孔(Pinhole)和检测器加压值(Master Gain)，具体影响可见以下表格。另外我们可以使用Range Indicator进行判断图像荧光强度是否合适。

　　信噪比

　　在我们共聚焦软件界面里面，影响信噪比的因素主要有两个，分别是扫描速度(Speed)和平均次数(Average)，具体影响见下表。

　　▲ 不同信噪比图像比较

　　分辨率

　　分辨率是能区分开两个点之间的*小距离，所以分辨率越小越好，而分辨能力越大越好。

　　▪ 影响分辨率的一个重要因素是物镜的数值孔径(NA)值。NA值越大，分辨率越小。

　　▪ 除此之外我们还应该考虑图像的数码分辨率，也就是我们的Frame Size。一般情况下，我们选择 1024×1024的pixels就可以，但是如果采用Airyscan超高分辨率检测器采集图像，建议大家选择optimal作为*佳的Frame Size，以保证*佳的采样率哦。

　　▲ Acquisition Mode界面展示

　　▲ 不同分辨率图像比较，用免疫组化法标记的外胚层纤毛的基体(红色)和基脚(绿色)，由S.Kapoor, Max Planck提供(左图为LSM980 Confocal 模式拍摄，右图为LSM980 Airyscan 模式拍摄)

　　03图像对比度的调节

　　采集图片后，可能需要后期进行一些对比度和亮度的调节，使得我们的图像看起来更加的“漂亮”。而且对采集后图像进行对比度调节也不会影响我们的荧光强度哦。但是如果您想将两幅图像进行对比，建议将两幅图像的对比度数值保持一致。

　　▪ 其中Min/Max代表将Display按照荧光强度的*小值设为Black，*大值设为White，使得对比度更强一点。

　　▪ 如果直接点击Best Fit，那么灰度曲线按照后面设置的百分比作为Black和White的值。比如图中Best Fit设置的阈值为2.00和0.01，代表2% 的*暗的像素点的灰度值作为Black的阈值，0.01%的*亮的像素点的灰度值作为White的阈值，使得图像的对比更加的明显。

　　▪ 我们也可以自己手动拖拉Black和White的阈值进行调节。

　　▪ Gamma值则代表曲线的曲率，一般情况下，我们荧光图像Gamma选择1.0。

　　▲ 不同对比度，不同的展示效果(图1：Black=0、Gamma=1、White=16384;图2：Black=1028、Gamma=1、White=7143;图3：Black=1028、Gamma=0.5、White=7143)

　　04Info的查看

　　那么我们成功采集一张图像之后，应该怎样查看该图像的采集参数呢?

　　可以直接打开这张图像，然后选择Info选项卡，里面包含了物镜信息、维度信息、坐标信息、拍摄信息、图像信息等等。

　　蔡司的CZI格式包含了476条的metadata信息。Metadata 对于图像分析、进一步图像处理以及自动显微镜控制非常重要!这也是工程师小伙伴一再强调大家一定要保存CZI格式数据的原因哦。

　　▲ Info界面展示

　　以上就是这次光学课的全部内容啦，除了蔡司君讲到的以上四点，相信大家在实际操作过程中还积累了许多经验。