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同为蔡司激光共聚焦显微镜的粉丝,您是否也想在研究工作过程中拍摄出神奇美妙的显微图像呢?今天,蔡司君就和您分享一些有关共聚焦成像的小知识,从参数设置方面入手,助您最终获取理想的图像。
下图为采用Airyscan2技术Multiplex模式拍摄的DNA染色的海拉细胞,由德国哥廷根马克斯・普朗克生物物理化学研究所A. Politi、J. Jakobi以及P. Lenart提供。
01物镜选择及光路设置
首先如果您想获取一张漂亮的图像,合适的物镜选择以及正确的光路设置是必不可少的。
物镜
物镜本身上面有几个重要的参数,分别是放大倍数、NA(数值孔径)以及所需介质:
▪ 放大倍数直接关系到您能看到的视野的大小;
▪ NA值跟分辨率有直接的关系,选择数值孔径(NA)越大的物镜,分辨率越好,看到的细节越多;
▪ 使用合适的介质也很重要。有些物镜的要求是Air,即空气镜;有些的标注是W,即水镜;还有些是Oil,即油镜。在使用物镜前要注意介质的正确使用哦。
▲ 不同介质的物镜(从左到右依次为空气镜、油镜和水镜)
光路设置
▪ 使用过蔡司激光共聚焦显微镜的小伙伴们都知道,我们软件里面有Smart Setup,可以直接选择染料信息,硬件自动配置好所需的一切,简单容易上手。
▲ Smart Setup染料设置界面
▪ 如果您对实验有其他的要求也可以自己设置光路,设置需要的激光、检测器和收集波段。所以实验前一定要清楚自己所使用染料的激发波段和发射波段哦。
▲ Imaging Setup界面
02图像采集参数设置
什么是好看的共聚焦显微图像呢?可能每个人对美的定义不同,但是想得到一张漂亮的图像也需要具备*基本的三个条件,分别是荧光强度合适、优异的信噪比、较高的分辨率。
荧光强度
影响荧光强度的主要有三个参数,分别是激光强度(Laser)、针孔(Pinhole)和检测器加压值(Master Gain),具体影响可见以下表格。另外我们可以使用Range Indicator进行判断图像荧光强度是否合适。
信噪比
在我们共聚焦软件界面里面,影响信噪比的因素主要有两个,分别是扫描速度(Speed)和平均次数(Average),具体影响见下表。
▲ 不同信噪比图像比较
分辨率
分辨率是能区分开两个点之间的*小距离,所以分辨率越小越好,而分辨能力越大越好。
▪ 影响分辨率的一个重要因素是物镜的数值孔径(NA)值。NA值越大,分辨率越小。
▪ 除此之外我们还应该考虑图像的数码分辨率,也就是我们的Frame Size。一般情况下,我们选择 1024×1024的pixels就可以,但是如果采用Airyscan超高分辨率检测器采集图像,建议大家选择optimal作为*佳的Frame Size,以保证*佳的采样率哦。
▲ Acquisition Mode界面展示
▲ 不同分辨率图像比较,用免疫组化法标记的外胚层纤毛的基体(红色)和基脚(绿色),由S.Kapoor, Max Planck提供(左图为LSM980 Confocal 模式拍摄,右图为LSM980 Airyscan 模式拍摄)
03图像对比度的调节
采集图片后,可能需要后期进行一些对比度和亮度的调节,使得我们的图像看起来更加的“漂亮”。而且对采集后图像进行对比度调节也不会影响我们的荧光强度哦。但是如果您想将两幅图像进行对比,建议将两幅图像的对比度数值保持一致。
▪ 其中Min/Max代表将Display按照荧光强度的*小值设为Black,*大值设为White,使得对比度更强一点。
▪ 如果直接点击Best Fit,那么灰度曲线按照后面设置的百分比作为Black和White的值。比如图中Best Fit设置的阈值为2.00和0.01,代表2% 的*暗的像素点的灰度值作为Black的阈值,0.01%的*亮的像素点的灰度值作为White的阈值,使得图像的对比更加的明显。
▪ 我们也可以自己手动拖拉Black和White的阈值进行调节。
▪ Gamma值则代表曲线的曲率,一般情况下,我们荧光图像Gamma选择1.0。
▲ 不同对比度,不同的展示效果(图1:Black=0、Gamma=1、White=16384;图2:Black=1028、Gamma=1、White=7143;图3:Black=1028、Gamma=0.5、White=7143)
04Info的查看
那么我们成功采集一张图像之后,应该怎样查看该图像的采集参数呢?
可以直接打开这张图像,然后选择Info选项卡,里面包含了物镜信息、维度信息、坐标信息、拍摄信息、图像信息等等。
蔡司的CZI格式包含了476条的metadata信息。Metadata 对于图像分析、进一步图像处理以及自动显微镜控制非常重要!这也是工程师小伙伴一再强调大家一定要保存CZI格式数据的原因哦。
▲ Info界面展示
以上就是这次光学课的全部内容啦,除了蔡司君讲到的以上四点,相信大家在实际操作过程中还积累了许多经验。